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Ca++ Mg++-ATP 酶活性測定說明書
可見分光光度法
產(chǎn)品說明：
Ca++ Mg++-ATP 酶廣泛分布于植物、動物、微生物和細胞中，可催化ATP水解生成ADP和無機磷。根據(jù)Ca++ Mg++-ATP酶分解ATP生成ADP及無機磷，通過測定無機磷的量來確定ATP 酶活性高低。
需自備的儀器及用品：
可見分光光度計、水浴鍋、臺式離心機、可調(diào)式移液器、1mL 玻璃比色皿、研缽、冰和蒸餾水。
試劑的組成和配制：
提取液：液體50mL ×1 瓶，4℃保存。試劑一：液體 10mL×1 瓶，4℃保存。試劑二：液體 5mL×1 瓶，4℃保存。試劑三：液體 5ml×1 瓶，4℃保存。
試劑四：粉劑×3 支，-20℃保存。用時每支加1mL 蒸餾水，現(xiàn)用現(xiàn)配。用不完的試劑-20℃ 可保存一周。
試劑五：液體 5mL×1 瓶，4℃保存。
試劑六：粉劑×1 瓶，4℃保存。用時加入3mL 蒸餾水， 4℃保存。
試劑七：粉劑×1 瓶，4℃保存。用時加入25mL 蒸餾水，溶解后4℃保存一周。試劑八：粉劑×1 瓶，4℃保存。用時加入25mL 蒸餾水，溶解后4℃保存一周。試劑九：液體25mL×1 瓶，室溫保存。
試劑十：10mmol/L 標準磷貯備液 10mL×1 瓶，4℃保存。
0.5μmol/mL 標準磷應用液配制：將試劑十20倍稀釋，即取 0.1mL試劑十加1.9mL蒸餾水充分混勻
定磷劑的配制：按H2O: 試劑七:試劑八:試劑九=2:1:1:1 的比例配制，配好的定磷劑應為淺黃色。若無色則試劑失效，若是藍色則為磷污染，定磷劑現(xiàn)用現(xiàn)配。
注意：配試劑zui好用新的燒杯、玻棒和玻璃移液器，也可以用一次性塑料器皿，避免磷污染。
樣品酶液的制備：
1、 細菌、細胞或組織樣品的制備：
細菌或培養(yǎng)細胞：先收集細菌或細胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細菌或細胞數(shù)量（104 個）：提取液體積（mL）為500~1000：1 的比例（建議500 萬細菌或細胞加入1mL 提取液）， 超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復30 次）；8000g 4℃ 離心10min，取上清，置冰上待測。
組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10 的比例（建議稱取約0.1g 組織， 加入1mL 提取液），進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。
2、 血清（漿）樣品：直接檢測。
操作步驟：
1、 分光光度計預熱30min 以上，調(diào)節(jié)波長至660nm，蒸餾水調(diào)零。
2、 酶促反應（在 EP 管中加入下列試劑）
| 對照管 | 測定管 |
試劑一（μL） | 130 | 90 |
試劑二（μL） | 40 | 40 |
試劑三（μL） | 40 | 40 |
試劑四（μL） | 40 | 40 |
試劑五（μL） |
| 40 |
樣本 （μL） |
| 200 |
混勻，37℃（哺乳動物）或 25℃（其他物種）準確水浴 10min。 | ||
試劑六（μL） | 50 | 50 |
樣本 （μL） | 200 |
|
混勻，8000g，常溫離心 10min，取上清液 | ||
3、 定磷（1.5mLEP 管中依次加入下列試劑）
| 空白管 | 標準管 | 對照管 | 測定管 |
0.5μmol/ml 標準磷應用液（μL） |
| 100 |
|
|
上清液（μL） |
|
| 100 | 100 |
蒸餾水（μL） | 100 |
|
|
|
定磷試劑（μL） | 1000 | 1000 | 1000 | 1000 |
混勻，室溫放置 30 min，在 660nm 處比色。
注意事項：
1、 由于每一個樣都必須做對照，本試劑盒50管只能測24份Ca++ Mg++-ATP 酶。
2、 此法具有微量、靈敏、快速的特點。所以對測定所用試管要求嚴格無磷。避免磷污染是檢測成敗的關鍵。
3、 空白管和標準管只要做一管。
計算
1、 血清（漿）Ca++ Mg++-ATPase 活力的計算:
定義：規(guī)定每小時每毫升血清（漿）中Ca++ Mg++- ATP酶分解ATP產(chǎn)生1μmol無機磷的量為一個酶活力單位。
Ca++ Mg++-ATP 酶活力（U/mL）=[ C 標準管×V 總]×（A 測定管-A 對照管）÷（A 標準管-A空白管）÷V 樣÷T=7.5×（A 測定管-A 對照管）÷（A 標準管-A 空白管）
2、 組織、細菌或細胞中Ca++ Mg++- ATPase 活力的計算：
（1） 按蛋白濃度計算：
定義：每小時每毫克組織蛋白中Ca++ Mg++- ATP酶分解ATP產(chǎn)生1μmol無機磷的量為一個酶活力單位。
ATP 酶活力(U/ mg)=[C 標準管×V 總]×（A 測定管-A 對照管）÷（A 標準管-A 空白管）
÷（V 樣×Cpr）÷T =7.5×（A 測定管-A 對照管）÷（A 標準管-A 空白管）÷Cpr
（2） 按樣本鮮重計算：
定義：每小時每克組織中Ca++ Mg++-ATP酶分解ATP產(chǎn)生1μmol無機磷的量為一個酶活力位。Ca++ Mg++-ATP 酶活力(U/g)= [C標準管×V總]×（A測定管-A對照管）÷（A標準管-A空
白管）÷(W× V 樣÷V樣總)÷T=7.5×（A測定管-A對照管）÷（A標準管-A空白管）÷W
（3） 按細菌或細胞密度計算：
定義：規(guī)定每小時每1萬個細菌或細胞中Ca++ Mg++-ATP 酶分解ATP產(chǎn)生1μmol無機磷的量為一個酶活力單位。
Ca++ Mg++-ATP 酶活力(U/104)= [C標準管×V總]×（A測定管-A對照管）÷（A標準管-A空白管）÷(500×V 樣÷V樣總)÷T=0.015×（A測定管-A 對照管）÷（A標準管-A空白管）
C 標準管：標準管濃度，0.5μmol/mL；V 總：酶促反應總體積，0.5mL；V 樣：加入樣本體積，0.2mL ；V 樣總：加入提取液體積，1mL；T：反應時間，1/6 小時；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本鮮重，g；500：細菌或細胞總數(shù)，500 萬。
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